引言：细胞冻存是细胞培养体系中的一项关键保存技术，主要是通过超低温抑制细胞内的酶活性和代谢活动，使细胞进入“休眠”状态。规范化的冻存操作不仅能有效建立细胞库，还能显著减少连续传代培养所带来的资源消耗与污染风险。

一、实验原理

细胞的冻存实验的基本原理是基于低温生物学保护策略。利用超低温（通过利用液氮来实现）和二甲亚砜(DMSO)或甘油这两种无毒性的物质进入细胞中，从而降低细胞冰点，同时可增加细胞膜对水的通透性。配以缓慢冷冻的方式，避免细胞内外水分形成冰晶从而对细胞造成机械损伤，以保证细胞能在液氮中长期的稳定保存。

二、实验材料

器材 ：培养的贴壁细胞（70%-80%融合度）、离心管、吸管、冻存管、离心液、液氮罐、超净工作台。

试剂：0.25%胰蛋白酶消化液、细胞冻存液、液氮。

三、实验步骤

1、细胞消化

参照传代的方法，使用0.25%胰蛋白酶对处于对数生长期的单层细胞进行消化。

2、细胞收集

将消化后的细胞收集至离心管，以800-1000 r/min离心5分钟。

3、重悬

弃去上清液，加入适量冻存液，使用移液枪缓慢轻柔冲刷细胞悬液，细胞密度调整至 5×10⁶ ~ 1×10⁷个/mL。

4、分装

将细胞悬液以1 mL/管分装至每个冻存管中，拧紧冻存管盖，并用蜡膜密封住。

5、标记

在冻存管上标注好细胞种类、冻存日期及冻存人名等。

6、程序降温

将冻存管放置在以下操作条件及环境条件下逐步进行冻存操作：4°C 放置1小时 → -20°C 放置2小时 → -85°C 放置2小时 → 最终转移至液氮中保存。

四、关键注意事项

1、细胞状态

优先选择对数生长期的细胞进行冻存，这个阶段的细胞增殖能力强，冻存后存活率较高。

2、操作把控

需把握好细胞的消化时间。消化过度会导致造成细胞的损伤，进而影响到细胞复苏后的存活率。复苏接种时细胞浓度建议控制在5×10⁶ ~ 1×10⁷个/mL，以确保细胞的成功复苏。

3、密封与防护

务必确保冻存管盖的密封完全，避免复苏时细胞外溢。对于类似胚胎干细胞这种耐冻性较差的细胞，建议在冻存管外包裹一层棉花，作为一层缓冲层，以避免冻存过程中细胞受到损伤。