▪ 在细胞冷冻的过程中，低温环境会促使细胞内的酶活性会停止代谢，细胞进入休眠状态，达到细胞保种的目的。

▪ 细胞自身含有的水分会随着温度的降低结晶，所形成的冰晶会直接将细胞膜刺穿造成细胞内部结构破坏，导致细胞死亡或大面积损伤。为了保护细胞，在冻存中需要添加适当的冷冻保护液。

▪ 细胞冻存液常用成份有胎牛血清、DMSO（二甲基亚砜）。FBS为细胞提供必要的营养物质和生长因子，维持细胞的活性和代谢活动。DMSO则能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶 的形成，减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。

▪ 细胞冻存操作需要遵循“慢冻”原则，通过实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。

1、用移液器吸弃原细胞培养液，对贴壁细胞进行清洗，弃去上清后加入胰酶进行消化，终止消化后离心处理，吸弃上清收集细胞沉淀。

2、配制细胞冻存液，需要注意的是，DMSO溶于培养基时，将释放大量热量，所以配置好的细胞冻存液需要冷却后再使用，且不能将DMSO和细胞直接接触，否则会烫伤细胞，造成后续复苏细胞死亡。

3、在细胞计数后按照所需细胞数量分装在细胞冻存管中保存，做好细胞信息标记。注意做好冻存管瓶盖密封，以免在后续储存中有污染的风险。

4、分装好的冻存管转入程序降温盒，-80℃过夜，最后转移至液氮罐中长期储存。

5、悬浮细胞省略消化步骤，其他冻存步骤和贴壁细胞操作步骤一致。

1、 细胞在冻存前应选择汇合度在80%—90%左右，细胞活率在90%以上最佳，确保细胞在冻存时状态最佳，这样也为后续细胞复苏提高成功率。

2、冻存操作细胞时注意避免消化过度、吹打细胞力度过重、离心转速及时间避免过大，以免造成细胞损伤。

3、在加入细胞冻存液前，尽量吸干净离心后的细胞沉淀上清液，减少溶液残留，避免稀释冻存液浓度，影响冻存效果。

4、若没有程序降温盒的话，建议人工梯度降温储存细胞。可以将冻存细胞依次放于4℃中1小时，-20℃中2小时，-80℃ 过夜，次日在转入液氮保存。该冻存方式适用于大部分细胞，但原代细胞不建议按此操作。