摘要：全血中含有有核白细胞，因此从血液中抽提 RNA 比较方便，但是红细胞富含核糖核酸酶，所以从血液中分离 RNA 奋其持殊的难度。因此若能先将有核白细胞与红细胞分离开来，从血液中抽提 RNA 更易成功。下述方法是酸-酚. 胍法•硫氰酸胍吋裂解细胞，并有效地灭活核糖核酸酶。

一、实验准备

1. 鲜血提取准备

磷酸盐缓冲液 (PBS)、淋巴细胞分离液、RNAzolB (Biogencsis,UK）、氯仿、异丙醇、乙醇、5mol/L 氯化钠、DFPC 处理的水、10ml离心管。

2. 冻血提取准备

1.5X 溶液 D:6mol/L 硫氰酸胍，37.5 mmol/L 柠檬酸钠 pH7.0,0.75% 十二烷基肌氨酸钠 H0.15mol/L2-巯基乙醇；酚：氯仿（5:I，pH 约 4.0)；4,2mol/L 乙酸钠 pH4-0；异丙醇；乙醇；30ml离心管。

二、实验步骤

1. 新鲜血液提取RNA

1. 在 20 ml 无菌管中. 用磷酸盐缓冲液稀释抗凝全血 (2:l)10 mL。

2. 小心将 10 ml 稀释的血液加人离心管中，管中含有 3ml 淋巴细胞分离液。确保血液和分离液冇十分明显的界面. 二者间应极少或没有混合。

3. 室温下 400 g 离心 30〜40 min，或 800 g 离心 15 min。

4. 离心后获得澄清的溶液，聚集的红细胞沉到管底，单核细胞包括淋巴细胞形成明显的云样带位于上层血浆相和下层淋巴细胞分离液的界面。用吸头将单核细胞层移至另一离心管中。

5. 加入 1XPBS 至混合均句，如步骤 3 离心。

6. 去掉上层溶液. 在该状态下，淋巴细胞可在-20℃ 储存几天。

7. 加人 0.RMAzolB 裂解细胞，反复用吸头吹打，以充分吹打以溶解细胞。

8. 移人另一无菌 Eppendorf 管中，加入 50u1 氯仿，剧烈振荡 15s，4℃ 或冰上孵育 5 min，样本可在该状态保持 1〜2 h。

9. 12000 g 离心 15 min。

10. 将上层水相移至一个新的 Eppendorf 管，小心避免与中间相混合，该中间相含 DNA 和蛋白质。加人等体枳异丙醇约 400ul,4℃ 或 20℃ 过夜。

11. 12000 g 高速离心 15mim，管底可见:RNA 沉淀。

12. 移去上清液，加入 800ul75% 乙醉冼涤 RMA 沉淀一次，7500 g 离心 8 min。

13. 加人 200ul0.2mol/L 氯化钠再溶解 RNA。用 400ul100% 乙醇沉淀 RNA，- 20℃ 放置 1h。

14.12000 g 高速离心 15 mm,RNA 沉淀用乙醇洗涤同上。

15. 打开管 L1，室温干燥 15 min。

16. 加人 50〜100ulDEPC 处理的水，溶解 RNA, 为增加溶解度，可在 52〜60℃ 助溶 5〜I5 min。

17. 定量分析 RNA。

2. 冰冻血液提取RNA

1. 水浴加热 2 ml(或 5 ml) 的冰冻全血。

2. 标本充分融化后，将其移人无菌的 30 ml 离心管中，内含 3 ml(或 5 ml)1.5XD 溶液，混合均匀。加人 6 ml(或10ml) 酚：氯仿（冰上孵育 20mim5:1) 和0.5 ml（或 1 ml)4.2mol/L 乙酸钠，PH4.0, 混合均勻，混合时最好用封口膜封口。

3. 冰上孵育 20mim。

4. 5500 g，4℃ 离心 30 min。

5. 转移上清液至另一离心管中。

6. 加人等体积的异内醇，- 20℃ 过夜。

7. 5500 g 离心 30 min。

8. 弃上清液，将管倒置 2〜3 min。

9. 12000 g 离心 15 min。

10. 室温下 11000 g 离心10min。

11. 弃上清液，加人 750ul75% 乙醇洗涤沉淀，11000 g 离心 2 min。

12. 弃上清液，加人 50ulDEPC 处理水溶解 RNA。

13. 定量分析 RNA。

三、注意事项

1. 通风处理：RNAzolB 含有硫氰酸胍，该物质有刺激性，因此建议在通风橱中处理硫氰酸胍。

2. 抗凝剂选择：合适的抗凝剂是 3.8% 柠檬酸钠，1:10 稀释人全血。肝素可能干扰反转录和 PCR。

3. 静置观察：中间相可能非常弥散而看不到水相。遇此情况，可将标本放置，直到中间相沉积 (若需要，可以过夜)