摘要：细胞的原代培养实验是指对来自于供体的组织或细胞在体外进行首次培养。主要方法有两种：组织块法和消化法。本文以新生大鼠肝组织为例，并详细介绍组织块法与消化法，新手也能看懂。

一、组织块法实验

1、实验原理

组织块法原代培养实验是在对一些来源有限、数量较少的组织进行原代培养时最常用的原代细胞培养方法。

组织块法原代培养的基本原理是将将刚离体的、有旺盛生长活力的组织剪成小块，接种于培养瓶中，新生的细胞大约 24 h 后可从贴壁的组织块四周游出并生长。

利用此法进行的原代培养，操作过程简便、易行，培养的细胞较易存活。

2、实验准备

器材：新生大鼠、眼科剪、眼科镊、培养皿、培养瓶、弯头吸管、DMEM 培养基；

试剂：75%乙醇、D-Hanks液。

3、实验步骤

1. 用 75％ 乙醇棉球反复擦拭新生大鼠全身 3 遍。

2. 将大鼠移入超净工作台后，再用 75％ 乙醇擦拭 1 次。

3. 处死大鼠（断头法），用眼科剪打开腹腔，取出肝组织，置于培养皿中。

4. 用 D-Hanks 液反复冲洗肝组织 3 遍，去除血细胞。

5. 为避免杂细胞的污染，需用眼科镊将肝组织块上所附的结缔组织尽可能去除。

6. 将肝组织移入一新的培养皿中，滴 0.5 mL 培养基于肝组织上，用眼科剪将其剪成 1 mm3 左右的小块，同时用眼科镊将其彼此分开。

7. 用弯头吸管将剪碎的肝组织块吸起，移入培养瓶底部。

8. 用弯头吸管头移动肝组织块，使其均匀分布于培养瓶底部，小块间距控制在 0.5 cm 左右，数量为 15～20 块/培养瓶（25 mL）。

9. 吸取少量培养基，沿培养瓶颈缓缓滴入，培养基的量以恰好能浸润组织块底部、但不会使组织块漂浮为佳。

10. 将培养瓶轻轻放入培养箱中培养。

11. 24 h 后，可观察到有少量细胞从组织块周围游离而出，视需要补以少量培养基。

二、消化法实验

1、实验原理

消化法原代培养实验是用将组织块用消化处理获得细胞悬液，接种细胞悬液后部分细胞会黏附于基质开始生长。是原代细胞培养的常用方法。

2、实验准备

器材：新生大鼠、眼科剪、眼科镊、培养皿、培养瓶、锥形瓶、磁力搅拌器、磁力搅拌棒、倒置显微镜、恒温箱、含10％血清的 DMEM 培养基、离心机、不锈钢筛网（100 目）；

试剂：75%乙醇、D-Hanks液。

3、实验步骤

1. 将新生大鼠的肝组织用 D-Hanks 液漂洗 3 次。

2. 用眼科剪、镊将附着在肝组织上的结缔组织去除。

3. 将肝组织剪成 1～2 mm3 左右的小块，置于锥形瓶中，放入磁力搅拌棒，再注入 30～50 倍组织量的预热到 37 ℃ 的胰蛋白酶液。

4. 在磁力搅拌器上对肝组织块进行搅拌 10～20 min。也可将锥形瓶放入水浴或恒温箱中，每 5 min 摇动 1 次。如消化时间较长，可每隔 5 min 取出 2/3 上清液移入另一离心管，离心后去除胰蛋白酶加入含血清培养基，然后再给原锥形瓶添加新的胰蛋白酶继续消化。在 4 ℃ 条件下进行冷消化，消化的时间需延长至 12～24 h。如果肝组织块在冷消化一段时间后，可离心再添加胰蛋白酶，放入 37 ℃ 恒温箱中继续温热消化 20～30 min，效果会较好。

5. 吸取少量消化液在倒置显微镜下观察，若组织块已分散成小的细胞团或单个细胞，应立即终止消化。

6. 将消化液和分次收集的细胞悬液通过不锈钢网滤过，除掉未消化充分的大块组织。

7. 将收集的细胞悬液 800～1000 r/min 离心 3～5 min，去除含胰蛋白酶的上清液。

8. 用 D-Hanks 液漂洗 1～2 次，每次 800～1000 r/min 离心 3～5 min，去除上清液。

9. 加入含 10％ 血清的 DMEM 培养基，吹打沉淀制悬，按每 1 mL 5x105～1x106 个细胞的浓度接种到培养瓶，于 37 ℃ 条件下培养。