实验原理

利用抗原 - 抗体特异性结合，以马流感病毒 HA 蛋白为包被抗原，检测马血清中针对该病毒的特异性 IgG 抗体；通过酶标二抗放大信号，实现抗体的定量分析，反映马群感染状态或免疫水平。

操作步骤

1、包被：将纯化的马流感病毒 HA 蛋白用包被缓冲液（pH9.6 碳酸盐缓冲液）稀释至 1μg/mL，每孔 100μL 加入 96 孔板，4℃孵育过夜；洗板 3 次（PBST 缓冲液）。

2、封闭：每孔加入 200μL 5% 脱脂奶粉，37℃孵育 1 小时，洗板 3 次。

3、加样：马血清用稀释液（含 1% BSA 的 PBST）做 1:100 至 1:12800 梯度稀释，每孔 100μL，37℃孵育 1.5 小时；设阳性血清、阴性血清对照，洗板 3 次。

4、显色与读数：加入 HRP 标记的抗马 IgG 二抗（1:5000 稀释），37℃孵育 1 小时，洗板 5 次；加入 TMB 底物显色 10 分钟，2mol/L H₂SO₄终止反应，酶标仪测 450nm 吸光度（OD 值），计算抗体效价。

应用

1、马流感病毒感染的血清学诊断与流行病学调查；

2、马流感疫苗免疫效果评估（监测免疫后抗体水平变化）。