实验原理

将目标抗原包被在酶标板上，小鼠血清中的特异性抗体可与抗原结合；加入酶标记的二抗后，形成 “抗原 - 抗体 - 酶标二抗” 复合物，酶催化底物显色，吸光度值与抗体效价呈正相关。

操作步骤

1、抗原包被：将纯化抗原（如病毒蛋白、重组蛋白）用碳酸盐缓冲液（pH9.6）稀释至 1-5μg/mL，每孔 100μL 加入 96 孔板，4℃孵育过夜；PBST 洗板 3 次。

2、封闭：每孔加 200μL 5% 脱脂奶粉，37℃孵育 1 小时，洗板 3 次。

3、血清孵育：小鼠血清用稀释液做 2 倍梯度稀释（1:100 至 1:12800），每孔 100μL，37℃孵育 1.5 小时；设阳性、阴性血清对照，洗板 5 次。

4、酶标二抗孵育：加入 HRP 标记的抗小鼠 IgG 二抗（1:5000 稀释），每孔 100μL，37℃孵育 1 小时，洗板 5 次。

5、显色与读数：加入 TMB 底物显色 10 分钟，2mol/L H₂SO₄终止反应，酶标仪测 450nm 吸光度值，以OD 值≥阴性对照 2.1 倍的最高血清稀释度为抗体效价。

应用

1、评估疫苗（如新冠疫苗、流感疫苗）免疫小鼠后的抗体产生水平；

2、检测感染模型小鼠血清中病原体特异性抗体，辅助疾病诊断。